RESUMEN
Antecedentes: El uso de la biomasa comestible de Dichrostachys cinerea podría ser una
alternativa eficaz para el control de parasitosis en animales. Objetivo. Evaluar la toxicidad a dosis
límite de un extracto de legumbres, rebrote y hojas de planta adulta de D. cinerea en ratas. Métodos: Se utilizaron ratas adultas jóvenes de la especie Rattus norvegicus (variedad albina), de
la línea o cepa Sprague Dawley (Cenp: SD), de ambos sexos, con un peso entre
150 y 200 g, consanguíneas y heteroxénicas.
Se evaluaron tres extractos acuosos mediante maceración al 20% de biomasa
vegetal de, rebrotes, hojas de planta adulta y legumbres, mediante el ensayo de
toxicidad oral por dosis límite de 2000 mg / kg de masa corporal. Se controló
la ocurrencia de mortalidad y la aparición de síntomas o signos de toxicidad.
Se practicó necropsia y análisis macroscópico a los animales al final del
estudio en busca de lesiones. Se empleó el paquete estadístico STATISTICA,
versión 10 y se aplicaron los ensayos no paramétricos de Pares de Wilcoxon y U
de Mann Whitney, para comparar el peso inicial y final por sexos y el
incremento por sexos, respectivamente. Resultados: Las ratas de ambos sexos
incrementaron su masa corporal, lo que demuestra la no influencia negativa por
la administración del extracto. Se observó diferencias significativas en el
incremento de peso entre hembras y machos, no se observaron lesiones
macroscópicas o alteraciones patológicas relacionadas o achacables a la
administración del producto.
Conclusiones: El extracto acuoso de legumbres, rebrote y hojas de la planta
D. cinerea, no resulta tóxico a dosis
límite oral en ratas.
Palabras clave: dosis límite, legumbre, planta, rebrote (Fuente: BVS)
ABSTRACT
Background: The utilization of edible biomass of Dichrostachys
cinerea could become an effective alternative for the control of animal
parasitosis. Aim. To evaluate
toxicity at a limit dose of an extract of legumes, reshoots, and leaves of
adult D. cinerea plants in rats. Methods: The study
comprised young-adult albino consanguineous and heteroxenic rats (Rattus
norvegicus) of the Sprague Dawley (Cenp: SD) line, of both sexes, weighing
between 150 and 200 g. Three aqueous extracts by 20% crushing from plant
biomass, reshoots from the adult plants, and legumes were evaluated through an
oral toxicity test with a limit dose of 2000 mg/kg body mass. Mortality and
symptoms or signs of toxicity were controlled. A necropsy and microscopic
analysis of the animals at the end of the study was performed to detect
lesions. STATISTICA, version 10, was used, and the Wilcoxon and Man Whitney U
non-parametric paired tests were performed to compare the initial and final
weights by sexes, and weight gains by sexes, respectively. Results: The rats from both
sexes increased their body weight, demonstrating that the extract caused no
negative effect. There were significant differences in weight gains between the
males and females; no macroscopic lesions or pathological alterations
associated with the administration of the product were observed. Conclusions: The
aqueous extract of legumes, reshoots, and leaves of adult D. cinerea plants
administered to rats orally was not toxic at the limit oral dose in rats.
Keywords: limit dose, legume, plant, reshoots (Source:
BVS)
INTRODUCCIÓN
Durante las últimas cuatro décadas se
han desarrollado moléculas sintéticas antiparasitarias de gran eficacia, amplio
espectro y bajo efecto residual (Dorta-Contreras, 2007). Sin embargo, en la
actualidad el tratamiento de enfermedades parasitarias se ha complicado debido
a la resistencia a fármacos comerciales por lo que es necesario utilizar
alternativas para el control de estos patógenos resistentes o
multirresistentes, una de las cuales puede ser el uso de metabolitos
secundarios de plantas con actividad antibacteriana y/o sobre nematodos
gastrointestinales (Satyajit y Lutfun, 2012; Epe y Kaminsky, 2013; Medina et al., 2014; Hernández-Alvarado et al., 2018).
Existen numerosas investigaciones que
han abordado el estudio del potencial nutracéutico de diversas plantas, entre
ellas D. cinerea, cuyo uso aún no se
ha extendido en Cuba. Particularmente se señala su efectividad en el control de
nematodos gastrointestinales (Arece et al.,
2012) por lo que resulta válido asumir que el uso de la biomasa comestible de
esta planta podría ser una alternativa eficaz para el control de parasitosis en
pequeños rumiantes.
Los estudios toxicológicos y farmacológicos
de corte experimental constituyen un paso de la ruta crítica por la que
necesita transitar un nuevo producto, nutracéutico u otros, para su
establecimiento sobre bases científicamente sustentadas que aporten los
criterios de seguridad, consumo y disposición del producto en estudio (Repetto
y Repetto, 2012). El uso de preparados obtenidos de D. cinerea requieren de la
necesidad de caracterizar su seguridad toxicológica.
El objetivo del estudio fue evaluar
la toxicidad a dosis límite de tres extractos de legumbres, rebrote y hojas de
planta adulta de D. cinerea en ratas.
MATERIALES
Y MÉTODOS
El estudio se realizó en el
Laboratorio de Toxicología del Departamento Biológico del Centro de Bioactivos
Químicos de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas.
Identificación
de las sustancias de ensayo y del vehículo
Nombre de los productos:
Extracto acuoso de legumbres de D. cinerea (L.)
Extracto acuoso de rebrotes de D. cinerea (L.)
Extracto acuoso de hojas de plantas
adultas de D. cinerea (L.)
Obtención: Extracto acuoso mediante
maceración al 20% de biomasa vegetal consistente en legumbres, hojas de la
planta adulta y de sus rebrotes colectadas en una misma área y época del año.
El material vegetal se obtuvo de las legumbres, hojas de la planta adulta y de
sus rebrotes de D. cinerea
establecidas en áreas pertenecientes a la Cooperativa de Créditos y Servicios
“El Vaquerito”, ubicadas en la carretera a Camajuaní km 2.5, Santa Clara,
provincia de Villa Clara, Cuba.
Características organolépticas:
·
Color: Pardo verdoso oscuro
·
Apariencia: Líquido fluido.
·
pH: 6.6
Sistema de
ensayo
Se utilizaron Ratas jóvenes de la
especie Rattus norvegicus Berkenhout
1769 (variedad albina), de la línea o cepa Sprague Dawley (Cenp:SD), de ambos sexos, con un peso entre 150 g y 200 g,
consanguíneas y heteroxénicas. El peso se verificó con una balanza técnica
digital, marca Sartorius, ubicada en el mismo local de tenencia y alojamiento
de los animales. Las hembras fueron nulíparas y no gestantes. La variación de
peso de los animales utilizados en el ensayo no excedió de ± 20% de la media
del peso para cada sexo.
Los animales fueron asignados
aleatoriamente al grupo experimental. Al finalizar el estudio los animales
fueron sacrificados mediante el método eutanásico de concusión. Se evitó todo
sufrimiento innecesario y se tuvo en consideración principios y procedimientos
bioéticos.
Las condiciones de mantenimiento y
alimentación, alojamiento y adaptación, el procedimiento de identificación y la
limpieza y desinfección se realizaron teniendo en cuenta los procedimientos que
aseguraran el bienestar de los animales. El agua de beber suministrada fue agua
potable previamente esterilizada por autoclaveo. El acceso al agua y los
alimentos fue ad libitum durante todo
el estudio.
Las condiciones ambientales fueron:
Temperatura 22oC ± 3oC, Humedad relativa: 50% a 70%,
Ciclos luz-oscuridad: 12 / 12 horas e Intensidad luminosa: 200 lux a 250 lux.
Dichas variables climáticas se mantuvieron mediante aires acondicionados,
extractor de aire, sistema automatizado de apagado y encendido de luz
fluorescente debidamente programado.
Distribución y
formación de grupos experimentales
De los animales que fueron declarados
como aptos para el estudio, se asignaron aleatoriamente a cada grupo experimental
diez ratas necesarias. A cada grupo experimental se le asignaron cinco ratas de
cada sexo. Los animales de igual sexo permanecieron en cajas de policarbonato
tipo T-3 con cama de bagazo y bajo las mismas condiciones de tenencia durante
todo el ensayo. Dichas cajas se identificaron en la tapa de rejilla metálica
correspondiente.
El diseño y conformación de los
grupos experimentales se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Grupos experimentales.
|
Grupos
|
n y sexo
|
Dosis
|
|
Extracto hojas de planta adulta
|
5 hembras
|
2000 mg / kg masa corporal
|
|
5 machos
|
|
Extracto rebrotes
|
5 hembras
|
|
5 machos
|
|
Extracto legumbres
|
5 hembras
|
|
5 machos
|
Vía de
administración, dosis, frecuencia y duración
Vía de administración: los animales
se administraron por vía oral mediante una cánula rígida de acero con un
engrosamiento en la punta para evitar perforaciones esofágicas en los animales
al momento de la administración. Los animales estuvieron en ayuna durante la
noche anterior al inicio del ensayo. Posteriormente en la mañana se pesaron y
se les administró la sustancia de ensayo acorde al peso corporal. Se continuó
el ayuno por tres a cuatro horas posteriores, tras las cuales se repuso el
alimento. El agua de bebida nunca se retiró de las cajas de los animales en
ensayo.
Dosificación: Se administró el
producto a una dosis límite establecida internacionalmente para productos en
estudio cuya composición o datos experimentales previos hagan suponer que esta
provocará ninguna o muy poca toxicidad. El volumen de extracto que se administró
correspondió a una dosis de 2000 mg / kg de masa corporal.
Observaciones
clínicas
Los animales administrados se
observaron a simple vista durante las primeras 3-4 horas después de la
administración, donde se observó la ocurrencia de mortalidad o la aparición de
síntomas o signos de toxicidad. Posteriormente se realizaron observaciones uno
o dos veces por día, por 14 días.
Al finalizar el período de
observación de 14 días, a los animales se les practicó el sacrificio por el
método de concusión de eutanásico de concusión y se les realizó análisis
macroscópico patológico.
Peso corporal
Se pesaron los animales al inicio del
estudio y cada 7 días post-administración con una balanza técnica digital,
marca Sartorius. Las variaciones de peso se calcularon y registraron cuando la
supervivencia fue superior a 1 día. También se evaluó la ganancia de peso
corporal hasta que terminara el período de observación post administración.
Estudio
anatomopatológico
Se practicó necropsia y análisis
patológico macroscópico a los animales al final del estudio en busca de
lesiones y alteraciones macroscópicas.
Consideraciones
éticas
El estudio consideró los principios
de reducción del número de animales al no tener que emplear animales controles
y utilizar el mínimo número de ratas para este tipo de estudio. El personal que
ejecutó el estudio fue calificado en el uso de mamíferos de laboratorio y tuvo
en cuenta los procedimientos que disminuyen el stress, el distress y el
deterioro del estado higiénico sanitario, de modo tal que se garantizó durante
el estudio el bienestar de los animales mediante el mantenimiento de las
condiciones de tenencia para la especie, la no-variabilidad en las respuestas y
la validez y confiabilidad de los datos que se generaron.
Análisis
estadístico
Se realizó un análisis no paramétrico mediante el
estadistico U de Mann Whitney para comparar el incremento de los pesos por sexo
al inicio y al finalizar el estudio y una prueba de pares de Wilcoxon para
comparar los pesos del inicio con los del final por sexo. El nivel de
significación estadística fue de p ≤ 0,05. Los estudios fueron realizados
mediante el paquete estadístico STATISTICA, versión 10.
RESULTADOS
Y DISCUSIÓN
Se utilizaron en el ensayo 15 ratas
de cada sexo, clínicamente sanas y aptas para este tipo de estudio las cuales no
presentaron mortalidad ni ningún síntoma clínico que se asociara con la
administración del extracto acuoso de legumbre, rebrote y hojas de plantas
adultas de D. cinerea en los animales
de ambos sexos.
El peso de
los animales durante el estudio se comportó de manera creciente y lógica, de
acuerdo con el tiempo de duración del experimento.
La tabla 2
muestra que los animales en los que les fue administrado el extracto acuoso de
legumbres,
rebrote y hojas de planta adulta por vía oral; el peso promedio inicial, el
peso promedio final y el incremento de peso vivo fueron mayores en las ratas
del sexo macho.
Tabla 2.
Comportamiento del peso promedio (±DE) en ratas del estudio de toxicidad oral de los
extractos acuosos de legumbres, rebrote y de la hoja de planta adulta D. cinerea
|
Tratamientos
|
n
|
Sexo
|
Peso inicial (g)
|
Peso final (g)
|
Incremento de peso (g)
|
|
Legumbres
|
5
|
Machos
|
199,6 ± 13,97
|
235,8 ± 9,23
|
135 ± 8,15
|
|
5
|
Hembras
|
180,2 ± 3,42
|
234,6 ± 17,31
|
55,6 ± 8,50
|
|
Rebrote
|
5
|
Machos
|
199,8 ± 5,89
|
329,6 ± 12,34
|
129,8 ± 7,82
|
|
5
|
Hembras
|
176,4 ± 8,82
|
239,6 ± 9,50
|
63,2 ± 10,25
|
|
Hojas de Planta
adulta
|
5
|
Machos
|
204,8 ± 6,94
|
311,2 ± 11,45
|
106,4 ± 11,08
|
|
5
|
Hembras
|
202,4 ± 8,56
|
250,6 ± 12,81
|
48,2 ± 6,30
|
El análisis estadístico de la
evolución de la masa corporal de las ratas administradas con cada extracto
demostró la existencia de diferencias estadísticas significativas para un nivel
de significación de p ≤ 0,05,
al comparar los pesos iniciales y finales por sexos. Para ambos sexos siempre
el peso fue significativamente superior al finalizar el estudio lo que
demuestra un incremento positivo de este indicador de salud en las tres
evaluaciones (Gráfico 1).
|
Extracto de legumbres
|
|
a)
Comportamiento
en hembras (Wilcoxon Matched Pairs Test, p
= 0,043)
|
b)
Comportamiento
en machos. (Wilcoxon Matched Pairs Test, p
= 0,043)
|
|
|
Extracto de hojas de planta adulta
|
|
c) Comportamiento en hembras
(Wilcoxon Matched Pairs Test, p =
0,043)
|
d) Comportamiento en machos.
(Wilcoxon Matched Pairs Test, p =
0,043)
|
|
|
Extracto de rebrotes
|
|
e)
Comportamiento en hembras
(Wilcoxon Matched Pairs Test, p =
0,043)
|
f)
Comportamiento en machos.
(Wilcoxon Matched Pairs Test, p =
0,043)
|
Gráfico 1. Análisis del comportamiento del peso
corporal de ratas administradas con extractos de D. cinerea. Comparación del peso por sexo al inicio y al final
del estudio.
En cuanto al análisis realizado a la comparación del
incremento de peso corporal por sexos en los tres extractos, se demostró que
existieron diferencias significativas para
un nivel de significación de p
≤ 0,05,
a favor de las ratas machos sobre las del sexo hembras (Gráfico 2).
a) Extracto de legumbres b)
Extracto de hojas de planta adulta
c) Extracto de rebrotes
Gráfico
2. Análisis del incremento del peso corporal de ratas administradas con
extractos de de D.
cinerea. Comparación entre sexos (Mann-Whitney U Test, p = 0,012).
De manera
general las ratas de los diferentes
sexos incrementaron su masa corporal de manera significativa al finalizar el
estudio con respecto al inicio, comportamiento normal para el período de
desarrollo somático en que se encontraban y que demuestra la no influencia
negativa por la administración de los extractos en estudio.
Hubo
diferencias significativas para el incremento de peso entre hembras y machos,
comportamiento normal para esta especie y línea de rata. Dicho comportamiento
del peso, correlacionado con la edad de los individuos y con diferencias entre
sexos, fue verificado al comparar los pesos con los reportados por el Centro de
Recursos Animales (Animal Resources
Centre) en el Departamento de Información de Referencias de Roedores (Rodent
Reference Information), para animales de la misma línea y
edad de ratas (Animals Resources Centre, 2021).
En las
necropsias realizadas a la totalidad de los animales que se sacrificaron al
finalizar el período de exposición, no se observaron lesiones macroscópicas
indicativas de alteraciones patológicas ni atribuibles a la administración del
producto.
Varios investigadores
refieren efectos terapéuticos en
el uso de D. cinerea como medicina alternativa (cicatrizante, emético, antinflamatorio, y vermífugo entre otros), a través
de diferentes formas y partes
de la planta (Borges
et al., 2020).
El amplio uso de diferentes formas de
preparación obtenidas de diferentes partes de la planta D. cinerea
complementa la ausencia de toxicidad demostrable al administrar dosis límites
del extracto acuoso, por lo cual se declara como seguro para el uso
previsto.
CONCLUSIONES
El extracto acuoso de legumbres, rebrote y hojas
de la planta D. cinerea, no resulta tóxico a dosis límite oral en ratas.
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Contribución
de los autores
Concepción y diseño de la
investigación: AYBE, OMC, MSW, AMD, LLP, MRP; análisis e interpretación de
los datos: AYBE, OMC, MSW, AMD, LLP, MRP; redacción del artículo: AYBE, OMC,
MSW, AMD, LLP, MRP.
Conflicto
de intereses
Los autores declaran que no existen conflicto de intereses.
, Osmany
Marrero Chang **
, Leonel Lazo Pérez ***
