Abstract
Background: The ever-growing awareness of environmental problems has led to the
implementing of ecological alternatives in industrial production. Cellulases
and hemicellulases are the most commonly used enzymes
in industry, guaranteeing the effectiveness of production, with a reduction in
chemicals that pollute the environment. Aim. To select Bacillus
spp. strains that produce cellulases, β-mannanases,
and xylanases for use in animal nutrition. Materials and methods: Overall,
ten strains were studied in plates with minimum medium supplemented with Xylane Haye, algarroba rubber, and carboxymethylcellulose
for the production of xylanases, β-mannanases,
and endo cellulases, respectively. The plates were incubated at 37 ºC for 24
hours and were coated with 0.5% Congo red solution. The diameter of the
hydrolysis area, and that of the colony, were determined to calculate the
potency index. Results: All the strains showed the capacity to produce
study enzymes. As a result, 23.3% of enzymatic activity was considered good. Bacillus
subtilis E-44 was the strain with the best enzymatic activity in the three
substrates evaluated (3.01 ± 1.18; 3.82 ± 0.31, and 4.22 ± 0.23) for
cellulases, β-mannanases, and xylanases,
respectively. Conclusions: Bacillus subtilis E-44 was picked as
the best cellulase and hemicellulase-producing
strain, increasing their possibilities in animal nutrition and the food
industry.
Keywords: β-mannanases, bacterium, endonucleases,
hemicellulase, xylanases (Source: MeSH)
INTRODUCCIÓN
La concientización sobre los
problemas medioambientales ha conducido a la implementación de estrategias
ecológicas en la concepción de los procesos industriales (Angural et al.,
2020). Las tecnologías que conciben el uso de enzimas garantizan estos
preceptos, ya que permiten la utilización eficiente de las materias primas con
la generación mínima de residuos y la disminución en el uso de compuestos
químicos contaminantes (Danilova y Sharipova,
2020).
La demanda de las enzimas y su
aplicación en varias industrias crece continuamente. En el 2021 el mercado
mundial de las enzimas representó ganancias de 6,4 mil millones de dólares. Se
prevé que este valor aumentará a 8,7 mil millones para el 2026, con una tasa de
crecimiento anual compuesta del 3,6% (Benatti y
Polizeli, 2023). Las celulasas y las hemicelulasas
(mananasas y xilanasas) son
las enzimas más empleadas a nivel industrial, específicamente, el sector de la
alimentación demanda notablemente su uso, donde representan más del 30% del
mercado (Cann et al., 2020).
Las celulasas, mananasas
y xilanasas son hidrolasas que degradan los enlaces
glicosídicos presentes entre los carbohidratos de conforman sus respectivos
polímeros. Pertenecen a la familia glicosil
hidrolasas según el sitio de las enzimas activas en carbohidratos (Carbohydrate- Active Enzymes Database CAZy: http://www.cazy.org/) (Gonzalez-Gonzalez
y Miranda- Lopez, 2022).
También suelen ser reconocidas como enzimas fibrolíticas
o carbohidrasas (Gusakov
et al., 2011; Mousa et al., 2022).
Las enzimas celulolíticas
y hemicelulolíticas se obtienen esencialmente a
partir de microorganismos y una de las principales fuentes utilizadas por las
empresas biotecnológicas son las cepas de Bacillus (Su et al., 2020). Las
bacterias de este género son bacilos
Gram positivos formadores de endosporas que no sintetizan endotoxinas, razón por
la cual muchas especies se consideran como seguras. Estos microorganismos
tienen un sistema de secreción enzimática eficiente, lo cual les permiten
degradar una variedad de sustratos, posibilitándoles la supervivencia en
diversos ambientes. Esto los convierte en excelentes productores de enzimas de
valor industrial. Es importante destacar además que estas bacterias crecen
rápido y los tiempos de fermentación, por lo tanto, se hacen más cortos en
comparación con otros microorganismos productores de hidrolasas (Blibech et al.,
2019). Aproximadamente, el 50% del total de enzimas del mercado se
producen a partir de Bacillus
(Sulistiyani et
al., 2021).
Sin embargo, la producción de estos
catalizadores, depende de las condiciones ambientales donde se desarrollen
estos microorganismos; por lo que es importante mencionar que todos los Bacillus no
sintetizan siempre el mismo tipo de enzimas. Para ello es necesario realizar
una selección adecuada de los microorganismos en función del sustrato. A partir
de lo planteado anteriormente, esta investigación se propone seleccionar cepas
de Bacillus
productoras de celulasas, β-mananasas y xilanasas
para su utilización en la alimentación animal.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cultivo bacteriano
y preinóculo
El estudio se realizó con diez
cepas pertenecientes al género Bacillus, las cuales se aislaron en el Laboratorio de
Microbiología de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de
Matanzas. A partir de las muestras conservadas a -30 °C en caldo nutriente y
glicerol al 20%, se inocularon los matraces que contenían 50 mL de caldo nutriente y se incubaron a 37 °C en zaranda orbital
a 110 rpm durante 16 h hasta que la densidad óptica a 600 nm fue de 0,8 - 1.
Medio de cultivo
El ensayo
se realizó sobre placas Petri que contenían medio mínimo (MM) compuesto por
NaCl (0,1%), KH2PO4 (0,3%), K2HPO4
(0,6%), MgSO4 (0,12%), peptona (0,5%), extracto de levadura (0,3%),
agar (1,5%). Para evaluar cada enzima las placas se suplementaron con
carboximetilcelulosa (1%), goma de algarrobo (0,5 %) o xilano
de haya (1%). El pH del medio se ajustó a 7,5 con KOH (1 mol·L-1) y
se esterilizó a 121°C durante 15 min. Los reactivos químicos se adquirieron de
la firma Sigma-Aldrich.
Determinación in vitro
de la producción enzimática de xilanasas, mananasas y celulasas
Las cepas
se inocularon con un asa de siembra estéril sobre la superficie del medio de
cultivo y las placas se incubaron durante 24 h a 37 °C. El revelado de la
síntesis de las celulasas y hemicelulasas por las
bacterias se realizó al añadir la disolución de rojo congo
al 0,5% a cada placa y se dejó a temperatura ambiente durante cinco minutos;
posteriormente se realizaron tres lavados con NaCl 1 mol·L-1. El
índice de potencia (IP) se calculó mediante la relación existente entre el
diámetro de la zona de hidrólisis y el diámetro de la colonia medidos en
milímetros. Según el IP los microorganismos evaluados se clasificaron en
excelente (IP > 5,0), bueno (2,0 > IP < 5,0) y pobre (IP < 2,0) (Latorre et al.,
2016). Se empleó un pie de rey Vernier (marca Suertek
cap. Sensibilidad de ± 0,02 mm) para realizar las mediciones de los diámetros y
se utilizó un diseño completamente aleatorizado con cuatro réplicas para cada
enzima.
Análisis estadístico
El
análisis de los datos se realizó con el software estadístico Statgraphics Plus 5.0. Se
llevó a cabo el análisis de varianza simple para determinar la presencia de
diferencias estadísticamente significativas entre las cepas con respecto a los
sustratos evaluados. Para el contraste de las medias se realizó la prueba de Student-Newman-Keuls. La significación se estableció para p < 0,05. Los datos
se muestran como la media ±
la desviación estándar.
RESULTADOS
Se estudiaron
diez cepas de Bacillus
para evaluar la capacidad de producir enzimas hidrolíticas de interés
biotecnológico e industrial. Los resultados mostraron que el 100% de las
bacterias evaluadas mostraron la capacidad de producir endocelulasas,
β-mananasas y xilanasas.
A partir del análisis de los resultados, las cepas E-44 y C-31 se clasifican
como buenas productoras de las tres enzimas estudiadas. De igual forma, la cepa
45 BP se considera buena productora de β-mananasas.
El resto de las bacterias estudiadas en la presente investigación mostró
resultados inferiores en la actividad enzimática relativa de las enzimas
evaluadas, los cuales se clasifican como pobres. La Tabla 1
muestra el perfil de la actividad enzimática de las cepas investigadas.
Tabla 1: Valores de los índices de potencia de las cepas de Bacillus sp. evaluadas para la producción de xilanansas,
β-mananasas y celulasas.
|
Cepas de Bacillus
|
Celulasas
|
β -Mananasas
|
Xilanasas
|
|
5 BP 1
|
1,31 ± 0,05de
|
1,48 ± 0,08de
|
1,44 ± 0,14de
|
|
23 BP4
|
1,74 ± 0,05c
|
1,51 ± 0,20de
|
1,63 ± 0,17cd
|
|
45 BP5
|
1,49 ± 0,06cd
|
2,03 ± 0,09c*
|
1,90 ± 0,07c
|
|
48 BP6
|
1,48 ± 0,09cd
|
1,66 ± 0,04de
|
1,68 ± 0,09cd
|
|
54 BP7
|
1,16 ± 0,11e
|
1,63 ± 0,10de
|
1,41 ± 0,11de
|
|
55 BP8
|
1,69 ± 0,21c
|
1,57 ± 0,16de
|
1,68 ± 0,12cd
|
|
E-44 9
|
3,01 ± 0,18ª*
|
3,82 ± 0,31ª*
|
4,22 ± 0,23ª*
|
|
C-31 10
|
2,41 ± 0,22b*
|
2,55 ± 0,25b*
|
2,55 ± 0,25b*
|
|
12 BCm11
|
1,13 ± 0,07e
|
1,34 ± 0,11e
|
1,60 ± 0,15cd
|
|
6 BCm12
|
1,12 ± 0,14e
|
1,76 ± 0,14d
|
1,22 ± 0,14e
|
Los datos
representan la media ± desviación estándar de cuatro réplicas. Letras
diferentes en una columna indican diferencias estadísticamente significativas según la prueba de Student-Newmn-Keuls
para p< 0,05. Las
cepas marcadas con (*) se consideran buenas productoras de la enzima.
El índice de potencia calculado de
las enzimas producidas por Bacillus sp. E-44 es superior al
de las otras cepas estudiadas. El análisis de varianzas que comparó este
factor, encontró diferencias estadísticamente significativas para cada uno de
ellos en función de las cepas estudiadas; de manera que permite afirmar que
esta cepa es la que mostró la mayor actividad de las tres enzimas frente a los
sustratos evaluados y por lo tanto se selecciona como la mejor. En el revelado
del ensayo para la determinación de la producción de enzimas por Bacillus sp. E-44 (
Figura
1) se
pueden observar zonas claras alrededor del crecimiento del microorganismo en
las placas que contienen xilano, goma de algarrobo y
CMC como sustrato, lo cual indica que la bacteria expresó enzimas que
despolimerizan el sustrato presente en el medio de cultivo.
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DISCUSIÓN
La
bioprospección de microorganismos con capacidad para producir enzimas de
interés biotecnológico e industrial es un tema de actividad científica
constante. Para conseguir que esta búsqueda sea eficaz se requieren
metodologías de trabajo que sean rápidas, sensibles, replicables y económicas.
La técnica cualitativa más empleada es la propuesta por Teather
y Wood (1982), la cual se basa en el
crecimiento de los microorganismos sobre un medio mínimo de sales que contiene
el sustrato de la enzima que se desea evaluar y la presencia de un colorante
reportero de la despolimerización (Moreno y
Vélez, 2011).
En este
estudio se utilizaron el xilano de haya, la goma de
algarrobo y la carboximetilcelulosa como única fuente de carbono en el medio
selectivo empleado, el cual se combinó con el rojo congo.
Este colorante interactúa con los polímeros correspondientes en el medio, y al
excretarse las enzimas se producen disacáridos, monosacáridos y ácidos
orgánicos como producto de la degradación. La formación de un halo transparente
alrededor de la colonia es resultado de la disminución del pH (Li et al.,
2020).
Como
previamente se mencionó, la capacidad que tienen varias especies de
microorganismos de degradar sustratos complejos se debe a la producción de
enzimas extracelulares y depende en gran medida de la fuente de carbono que se
emplea (Rodrigues et al., 2020). Las celulasas, xilanasas
y β-mananasas son enzimas inducibles en
condiciones naturales por los productos de su propia acción. Algunos autores
plantean que las mismas se expresan constitutivamente a bajos niveles, de
manera que permiten la producción de fragmentos de bajo peso molecular que
actúan como sus propios inductores. La regulación de estas enzimas está
estrictamente controlada por los mecanismos de activación y de represión
catabólica; solamente se secretarán en presencia de su sustrato específico y la
disponibilidad de azúcares fácilmente asimilables reprimirá su producción (Behera et al.,
2017; Chauhan y Gupta, 2016).
El índice de
potencia (IP) es un indicador que se utiliza por varios autores para evaluar la
expresión de enzimas microbianas como celulasas (Li
et al., 2020), xilanasas (Latorre et al., 2015) y mananasas (Riaz et al., 2019). La actividad enzimática
relativa es un indicador equivalente al índice de potencia según Latorre et al.
(2015). Estos autores utilizaron la misma escala para la selección de
cepas de Bacillus spp. que sintetizan celulasas y xilanasas. Los resultados obtenidos permitieron su
clasificación como excelentes y buenas productoras de estas enzimas.
También, este
indicador se utilizó para seleccionar la cepa de Bacillus velezensis que excretó la mayor cantidad
de celulasas en un estudio realizado donde se evaluaron diez cepas (Li et al.,
2020). Los resultados estuvieron en correspondencia con los obtenidos en
esta investigación; incluso, estos fueron superiores. El índice de potencia
para la producción de celulasas de Bacillus sp. E-44 fue superior al
obtenido por Ma et al. (2020). De igual manera la cepa seleccionada en la
presente investigación mostró índices de potencia superiores a Bacillus subtilis US
191 para la producción de mananasas, la cual mostró
un índice de potencia de 1,60. (Blibech et al., 2019). Sin embargo, los
valores registrados en este estudios fueron inferiores a los obtenidos por Zhang et al.
(2018) para la producción de xilanasas en la
cepa de Bacillus velezensis
ZY-1-1. No obstante, estos datos concuerdan con los autores anteriores en el
sentido de que la actividad de las xilanasas fue
superior a la de las celulasas; lo que a decir de los mismos se debe a los
mecanismos de regulación de los genes que codifican las enzimas lignocelulósicas,
los cuales deben ser más investigados.
Las especies
del género Bacillus
se caracterizan por sintetizar enzimas extracelulares diversas, sin embargo, no
siempre todas tienen la capacidad de expresarlas con igual magnitud. Esto
sugiere que esta es una característica específica de la cepa en la que no
influye la especie y depende en gran medida del origen del microorganismo (Latorre et al.,
2016). Por otra parte, se informa en la literatura que la fase de
crecimiento, la temperatura y el pH afectan directamente la producción final de
enzimas extracelulares. Por tal motivo se optimizan diferentes condiciones de
cultivo para la secreción de estas biomoléculas, lo que confirma que la
expresión de estos catalizadores está estrictamente asociada con la adaptación
al crecimiento (Liu et al., 2023).
La bacteria
que mostró los mejores resultados en la síntesis de celulasas y hemicelulasas está identificada como Bacillus subtilis subespecie subtilis y se aisló a partir de
jugo de tomate en descomposición (Milián et al., 2014). Esta cepa resultó
tener características potenciales para utilizarse como aditivo con efecto
probiótico en animales de interés zootécnico (Milián
et al., 2017). Lo resultados
aquí obtenidos aumentan las posibilidades de utilizar a Bacillus subtilis E-44; esta vez en la producción
de enzimas que mejoren la calidad de los alimentos ricos en fibra, lo cual
incrementa el efecto probiótico de la misma (Luise
et al., 2022). Las celulasas, mananasas y xilanasas son
hidrolasas que comúnmente se emplean en la producción animal (Sathitkowitchai et
al., 2022).
Además de los
posibles beneficios para la nutrición de animales de interés zootécnico de las
enzimas producidas a partir de esta cepa, su uso podría extenderse a la
obtención de las mismas para aplicarse en otros renglones de la alimentación
que demanden su empleo. Esto incrementaría las posibilidades de su uso
industrial, por ejemplo: para mejorar la calidad de los jugos de frutas y
vegetales, aumentar los rendimientos en el proceso de producción de café
instantáneo, suavizar la masa del pan e incrementar su volumen y reducir el
deterioro de los alimentos (Behera et al., 2017; Chauhan y Gupta, 2016;
Kaur et al., 2021; Marimuthu et al., 2019).
Por otra
parte, la hidrólisis completa de los carbohidratos complejos presentes en la
biomasa lignocelulósica, requiere de mezclas con múltiples actividades
enzimáticas. Con este propósito, el uso de cocteles enzimáticos es más
apropiado que las enzimas purificadas, ya que disminuye los costos y los procesos
son más eficientes. Desde el punto de vista de la alimentación animal, los
cocteles enzimáticos tienen efectos positivos en la mejora del valor
nutricional de los alimentos al afectar los porcentajes de fibra detergente
neutra (FDN) y fibra detergente ácida (FDA) e incrementar los de nutrientes
digestibles totales (Weschenfelder et al., 2023). Una de las
estrategias más acertadas para la producción de cocteles enzimáticos es el
empleo de microorganismos que posean la capacidad de secretar dos o más enzimas
celulolíticas y hemicelulolíticas
(Angural et
al., 2020). En este sentido, sería conveniente evaluar las
potencialidades de B. subtilis
E-44 en la producción de cocteles enzimáticos frente a sustratos
lignocelulósicos complejos. Por otra parte, deben realizarse otros estudios
relacionados con la cuantificación de las actividades enzimáticas y la
determinación de la estabilidad de las enzimas a diferentes pH y temperaturas,
ya que los resultados que aquí se muestran constituyen un estudio preliminar y
el primer paso para seleccionar una cepa con potencialidades para producir
enzimas de interés biotecnológico e industrial.
CONCLUSIONES
La evaluación de la capacidad para producir celulasas y hemicelulasas
permitió seleccionar a dos cepas como buenas productoras. Sin embargo, Bacillus subtilis E-44 mostró la mayor actividad en la secreción
de celulasas, β-mananasas y xilanasas. Esto incrementa las potencialidades de su uso en la
alimentación animal y las perspectivas de su empleo en el sector de la
alimentación.
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Contribución
de los autores
Concepción y diseño de
la investigación: YRF, MMMT, ALVA, YPH; análisis e interpretación de los datos:
YRF, MMMT, ALVA, YPH, ZRA; redacción del artículo: YRF, ALVA, MMMT y ZRA.
Conflicto
de intereses
Los autores declaran que no existen
conflicto de intereses.
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, Madyu M. Matos Trujillo *